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ACTH-Bestimmung beim Hund -
Validierung eines Chemolumineszenz-Immunometrischen Assays und präanalytische Stabilisationa

von Dr. C. Schwedes1 und Dr. W. Müller2

1Tierärztliche Klinik Dr. Unger, Klinkerberg 3, 86152 Augsburg
2Labor Alomed, Öschlestr. 77, 78315 Radolfzell-Böhringen

Problemstellung

Erkrankungen , die mit hormonellen Störungen einhergehen, kommen insbesondere bei älteren Hunden häufig vor. Eine dieser Erkrankungen ist der Hyperadrenocortizismus, der durch eine Überproduktion von Cortisol durch die Nebennierenrinde gekennzeichnet ist. Hierfür kommen zwei Ursachen in Frage: einerseits die zu starke Anregung der Nebennierenrinde zur Cortisolausschüttung, bedingt durch eine zu starke Ausschüttung des Adrenocorticotropen Hormons (ACTH) im Hypophysenvorderlappen (HVL), andererseits eine autonome Überproduktion von Cortisol ohne äußere regulatorische Einflüsse. Eine zweite Erkrankung ist der Hypoadrenocortizismus (Morbus Addison), der durch eine Unterfunktion der Nebennierenrinde gekennzeichnet ist. Die Messung der ACTH-Konzentrationen im Blut kann Hinweise zur genaueren Charakterisierung der Erkrankung geben.

Klinisch bedeutsam ist die Bestimmung des ACTH-Spiegels in den Fällen, in denen ein M. Cushing oder ein M. Addison bereits diagnostiziert wurde und eine Differenzierung der Verlaufsform für die Erstellung des Therapieplans und die prognostische Einschätzung notwendig ist. Mit einer ACTH-Bestimmung lässt sich in vielen Fällen der high-dose Dexamethason Test, der eine zweimalige Blutentnahme im Abstand von 8 Stunden vorschreibt umgehen. Weiterhin kann die therapiebegleitende Kontrolle des ACTH-Spiegels wertvolle Hinweise zur Effizienz der Therapie geben.

Die ACTH-Bestimmung ist bisher in bezug auf die Probennahme und Versand sehr aufwendig: ACTH ist ein Peptidhormon, das von Proteasen in vitro schnell abgebaut wird. Die Empfehlung lautet daher, das Blut in eisgekühlte EDTA-Röhrchen abzunehmen, in der Kühlzentrifuge zu zentrifugieren und tiefgefroren auf Trockeneis zu versenden.

Erst kürzlich konnte gezeigt werden, dass eine Hemmung des Abbaus von ACTH mit Hilfe von Aprotinin (TrasylolÒ) möglich ist und so die Lagerungsfähigkeit der Proben soweit gesteigert werden konnte, dass auf ein Einfrieren verzichtet werden konnte. Dieses Verfahren wurde für einen Radioimmunoassay (RIA) entwickelt.

Die bisher übliche Methodik der ACTH-Bestimmung beruhte auf der Technik des RIA. Kürzlich wurde ein neuer, hochsensitiver immunoradiometrischer Assay entwickelt, der auch erfolgreich zur Bestimmung von ACTH beim Hund eingesetzt wurde. Dieser Assay wurde von der Herstellerfirma modifiziert: durch Kopplung der Antikörper mit Chemolumineszenzmarkern kann auf radioaktives Material verzichtet werden. Ziel unserer mit Hilfe der Gesellschaft zur Förderung kynologischer Forschung durchgeführten Arbeit war es,

  1. Eine von radioaktiver Belastung freie Methode der ACTH-Bestimmung mittels Chemolumineszenz für den Hund zu erproben und Referenzbereiche zu erstellen
  2. Die Erprobung einer Stabilisation des ACTH, so dass die Proben auf dem normalen Postweg verschickt werden können.

Dazu wurde zunächst die Analysemethode für die Tierart Hund validiert. Dann wurden bei gesunden Hunden Blutproben entnommen und einmal auf herkömmliche Weise behandelt, d.h. sofort tiefgefroren und auf Trockeneis verschickt, zum anderen mit einem Stabilisator versetzt und auf dem normalen Postweg ins Labor geschickt. Die Ergebnisse wurde verglichen und die zu erwartenden ACTH-Konzentrationen bei gesunden Hunden ermittelt.

Ergebnisse
Die Hemmung des ACTH-Abbaus mittels des von uns entwickelten Stabilisators ist möglich. Die Ergebnisse des Laborversuchs zeigt Abb. 1.:
                             
Beim Vergleich von 30 Proben mit und ohne Stabilisator war der in den Stabilisator-Cocktail-Proben ermittelte Wert im Schnitt 93,4 ± 15,3 % im Vergleich zu den reinen EDTA-Proben. Bei der Berechnung wurden Werte direkt an der Nachweisgrenze ausgeschlossen, da sie die prozentuale Berechnung verfälschen würden.
Der von uns ermittelte Median von ACTH-Konzentrationen bei gesunden Hunden lag bei 31,5 bzw 33 pg/ml in den EDTA bzw den Stabilisatorproben. Die 25 Prozent-Grenze lag bei 19, die 75% Grenze bei 48 pg/ml bei einer Spannweite von 4-230 pg/ml für die sofort tiefgefrorenen Proben und 2-195 pg/ml für das Stabilisator-Plasma (Abb. 2).
                            
Diese hohe Spannweite ist dadurch erklärbar, dass die Ausschüttung des Hormons ACTH immer stossweise erfolgt und es im Blut rasch abgebaut wird.

Schlussfolgerungen
Der von uns erprobte Chemolumineszenzassay zur ACTH-Bestimmung beim Hund in Kombination mit dem von uns entwickelten Stabilisationsverfahren ist möglich und unter den Bedingungen der tierärztlichen Praxis durchführbar. Es sind dafür jedoch spezielle Blutentnahmeröhrchen erforderlich.

Ausblick
Das Verfahren ist vielversprechend und soll in der weiteren Forschungsarbeit an klinischen Patienten mit Hyper- und Hypoadrenocortizismus überprüft werden. Insbesondere ist zu klären, inwieweit die ACTH-Bestimmung in dieser Form zur Differenzierung und ggf. Therapieüberwachung der verschiedenen Formen des Hyper- und Hypoadrenocortizismus geeignet ist.

a Vorgestellt auf der 8. Jahrestagung der Fachgruppe Innere Medizin und Klinische Labordiagnostik der DVG, 4. - 6.3.1999 in München

Weitere Literatur:
Schwedes C, Müller W, Bestimmung des endogenen ACTH beim Hund, Tierärztl Prax 2000; 28 (K): 65-70